1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем


^ 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и характеристики супрамолекулярных ферментативных систем

Иммобилизованные ферменты представляют собой важную и стремительно развивающуюся область энзимологии и биотехнологии [24, 28, 29].

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии в Хенникере (США) было введено 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в биохимическую терминологию понятие «иммобилизованные ферменты». Процесс иммобилизации ферментов можно рассматривать как методический прием, при котором молекулу белка включают в всякую фазу, отделенную от фазы самого раствора, но способную обмениваться с 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем ней молекулами субстрата либо модификатора (ингибитора, активатора и т.д.). Иммобилизованные ферменты имеют значительные достоинства по сопоставлению с нативными ферментными продуктами. Так, к примеру, они просто отделимы от обскурантистской среды. Это дает возможность приостановить реакцию 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в хоть какой момент, получить продукт, незагрязненный катализатором, и использовать ферментный продукт неоднократно. Иммобилизованные ферменты технологичны, что определяется возможностью вести биотехнологический процесс безпрерывно и регулировать скорость катализируемой реакции и 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем выход продукта методом конфигурации скорости протока. Подбором соответственных носителей и способов иммобилизации можно преднамеренно видоизменять такие характеристики ферментов, как специфика, рН- и термозависимость, также стабильность фермента при денатурирующих воздействиях. Успешное внедрение иммобилизованных 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем ферментов определяется выбором подходящего сочетания носителя и способа иммобилизации, также познанием кинетики реакций с ролью таких катализаторов [29].

Иммобилизованные ферменты можно использовать, приемущественно, в последующих направлениях: для анализа разных веществ; для картонной, текстильной, хим и лекарственной 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем индустрии; для обработки сточных вод; как фармацевтические средства [30-37]. Последнее является более ценным для медицины и ветеринарии. Целительные средства на базе иммобилизованных ферментов используются или в этом случае, когда нужный фермент отсутствует 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в тканях, вследствие генетических либо других нарушений, или в качестве агентов, разрушающих ненужные составляющие, к примеру, мочевину. Внедрение чужеродных (бактериальных) ферментов часто не нужно, вследствие того, что они могут стать предпосылкой 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем аллергических реакций и, не считая того, они очень неустойчивы. Иммобилизация позволяет обойти эти барьеры, потому что она увеличивает стабильность фермента и препятствует его взаимодействию с иммунной системой организма (к примеру, для освобождения крови 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем от мочевины в аппарате "искусственная почка" употребляться колонка с иммобилизованной уреазой). Такие ферменты используют в целительных целях тогда и, когда они нужны, но из-за разных патологических процессов их недостаточно в организме.


^ Носители 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем для иммобилизации ферментов

В качестве носителей для иммобилизованных ферментов могут употребляться разные вещества - природные и синтетические, органические и неорганические, высоко- и низкомолекулярные, но они все должны отвечать последующим требованиям: высочайшая хим и 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем био стойкость; высочайшая механическая крепкость, к примеру, к истиранию; возможность получения разных форм - гранул, пластинок, мембран, трубочек и т.д.; высочайшая гидрофильность, обеспечивающая возможность связывания фермента с носителем в аква 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем фазе; легкость активации фермента, связанного с носителем; способность носителя к наибольшей "нагрузке" ферментом, потому что высочайшая концентрация фермента на носителе позволяет уменьшить размеры реактора; низкая цена. Органические высокомолекулярные носители делят, обычно, по 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем происхождению на природные и синтетические полимеры.

Природные полимеры, применяемые для иммобилизации разделяются на белковые, полисахаридные и липидные. Более обширно в качестве носителей употребляются полисахариды, такие как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Их преимуществом 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем являются доступность, наличие разных многофункциональных групп, высочайшая степень гидрофильности, недочетом - чувствительность к действию микробов и высочайшая цена. Синтетические полимерные носители для иммобилизации ферментов создаются на базе многих полимеров (производные 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем стирола, акриловая кислота, поливиниловый спирт, полиуретан и т.д.).

Понятно, что in vivo большая часть ферментативных реакций протекает на поверхности внутриклеточных либо клеточных мембран, потому модель фермент-липид более приближена к условиям 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем функционирования энзима в клеточке. Липидные носители употребляются в виде монослоев на разных поверхностях либо в виде бислоев сферической формы (липосомы либо везикулы). Простота получения, легкость регенерации иммобилизованного катализатора, возможность использования его in vivo содействовали обильному 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем применению липосом либо везикул в качестве носителей ферментов и фармацевтических препаратов.

В текущее время в качестве носителей внедряются синтетические аналоги липидов - поверхностно-активные вещества (ПАВ). Они имеют амфифильную природу 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и содержат неполярную углеводородную часть и полярную «головку», от содержания в какой разных многофункциональных групп различают 4 типа ПАВ: анионные, катионные, неионные и цвиттерионные. Многие из узнаваемых ПАВ являются продуктами крупнотоннажного производства. Синтетическими аналогами липидов 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в качестве носителей для иммобилизации являются моющие средства (СМС), в состав которых входят консистенции ПАВ с протеолитические ферментом.

Неорганические носители - это матрицы на базе силикагеля, глины, керамики, природных минералов и их оксидов 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем. Они могут быть пористыми и непористыми и используются в виде шариков и монолита. Достоинства этих носителей в легкости регенерации и придании им хоть какой конфигурации.


^ Способы иммобилизации ферментов

Способы иммобилизации ферментов подразделяют 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем на физические и хим (при использовании последних меж ферментом и носителем образуются ковалентные связи).

^ Физические способы. Самым известным и легкодоступным методом иммобилизации является физическая адсорбция. В базе этого метода лежит физическое 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем либо ионное взаимодействие фермента с носителем, который может быть как неорганическим, так и органическим веществом. Проведение адсорбции очень обычный процесс и заключается в контакте аква раствора фермента с носителем и отмывке не адсорбированного фермента 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем. Более комфортным методом является колоночный, когда раствор фермента «прокачивают» через колонку с носителем и следующее отмывание проводят в этой же колонке. Достоинства адсорбционной иммобилизации - простота методики, доступность и дешевизна 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем сорбентов, возможность придания им хоть какой формы. Недочет - десорбция и ее последствия. Это связано с тем, что сорбция обратима, она находится в зависимости от рН и ионной силы раствора, температуры, удельной поверхности и пористости носителя 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, концентрации субстрата и т.д. Недочетов адсорбции удается избежать при иммобилизации ферментов в поры геля. Это тоже физический способ, заключающийся в том, что энзим вроде бы погружают в матрицу геля 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, отделяющего его от субстрата полупроницаемой оболочкой. Методически такая процедура производится разными методами: а) готовый полимерный гель пропитывают веществом фермента, но так как этот метод просит много времени, а приобретенный продукт обладает низкой 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем удельной активностью, он применяется изредка; б) фермент заносят в раствор мономеров до проведения их полимеризации; в) фермент заносят в раствор готового полимера до его перехода в гель. Гели, применяемые для иммобилизации ферментов, содержат 50-90% воды 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, заполняющей место меж полимерными цепями. Фермент, заключенный в матрицу геля, не может выйти наружу, во-1-х, так как расстояние меж примыкающими цепями полимера меньше размеров его молекулы и, во-2-х 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, из-за наличия ионных и водородных связей фермента с носителем.

Для иммобилизации ферментов используются как несшитые полимерные гели, образующиеся полисахаридами (крахмалом, агар-агаром, альгинатом, каррагинаном и др.) при охлаждении их жарких смесей 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем; так и сшитые полимерные гели, образуемые поливиниловым спиртом (ПВС) либо поливинилпирролидоном, в каких при воздействии ультрафиолетового света, гамма-излучения либо потока электронов появляются свободные радикалы, что приводит к образованию ковалентных сшивок 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем меж цепями.

В текущее время обширное распространение получили сшитые гели на базе производных акриловой кислоты - полиакриламидные гели (ПААГ). Включение фермента проводится на стадии синтеза полимера из мономера - акриламида в присутствии сшивающего агента – метилен-бисакриламида. Образующийся 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем блок геля с включенными в его матрицу молекулами фермента может быть подвергнут механическому воздействию для получения частичек разной величины и формы (шарики, волокна, пленки и т.д.). Достоинства для ферментов, включенных в 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем матрицу геля, состоят в том, что активный центр фермента не блокирован и фермент накрепко защищен от деяния микробов. Недочеты: фермент может вымываться из геля и полимерная матрица может в некий мере 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем препятствовать проникновению субстрата в гель, снижая таким макаром активность фермента [30-37].

Другие взаимодействия появляются меж носителем, ферментом и субстратом при иммобилизации ферментов с внедрением полупроницаемых оболочек. К примеру, микрокапсулирование – довольно обычной способ, основанный 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем на разработке вокруг капелек ферментного раствора полупроницаемых микрокапсул определенных размеров и пористости. Способ двойного эмульгирования состоит в том, что эмульсию, полученную при микрокапсулировании, диспергируют повторно в воде. Из капель органического 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем раствора полимера появляется аква смесь, содержащая еще больше маленькие капли аква раствора фермента. При затвердевании органического раствора образуются полимерные сферические частички, снутри которых заключены молекулы ферментов.

Одним из новых и многообещающих является 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем способ включения ферментов в везикулы. Везикулы - это концентрические сферы из двойных фосфолипидных слоев. Везикулы с включенными в их продуктами употребляют в медицине для введения неких фармацевтических средств и в базовых исследовательских работах в 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем качестве системы, имитирующей клеточки. Все способы с внедрением полупроницаемых оболочек ординарны, универсальны и позволяют получать разные формы иммобилизованного биокатализатора - капсулы, волокна, шарики и т.п. При всем этом ферменты довольно размеренны 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, их активность не ограничивается явлением диффузии, а деградация под действием микробов исключается. Как и для ферментов, заключенных в гелевую матрицу, внедрение высокомолекулярного субстрата не представляется вероятным, вследствие того, что он не сумеет пройти через полупроницаемую 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем мембрану носителя.

^ Хим способы. При использовании хим способов иммобилизации меж ферментами и носителем появляются ковалентные связи. Ковалентные связи образуются за счет того, что ферменты, являясь субстанциями белковой природы, содержат на поверхности 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем молекулы разные многофункциональные группы: гидроксильные, карбоксильные, тиоловые, амино-, имидазольные, гуанидиновые и т.д. Самые обскурантистские - это SH-группы, принимающие роль в реакциях окисления, ацилирования, алкилирования и др. Эти группы играют огромную 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем роль в стабилизации белка-фермента с помощью дисульфидных мостиков. Потому что сульфгидрильные группы входят в активный центр многих ферментов, их не употребляют для иммобилизации, а, напротив, защищают. В качестве группы - мишени 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем при хим иммобилизации в большинстве случаев употребляют высокореакционные аминогруппы белка, которых довольно много и роль которых в поддержании структуры фермента второстепенна. Ковалентная иммобилизация ферментов позволяет получать препараты с данными и контролируемыми качествами, но, вследствие накладности 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и трудности получения таких биоматериалов, их создание и применение в больших масштабных ограничено.


^ Характеристики иммобилизованных ферментов

Ферменты испытывают на для себя воздействие среды, потому окружить фермент нерастворимым полимером - это видоизменять 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем его характеристики. К примеру, полимерная матрица, к которой прикреплен фермент, может препятствовать проникновению к ферменту субстрата либо выходу в среду товаров реакции либо же она, накрепко «прикрывая» фермент, лишает его подвижности, нужной 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем для выполнения каталитических функций. Таким макаром, характеристики иммобилизованных ферментов связаны с воздействием полимерной матрицы на «микроокружение» фермента и конкретно на его активность, также с разными эффектами, воздействующими на реальное поведение катализатора (термин 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем «микроокружение» употребляется для наименования среды снутри полимерной матрицы). Обычно активность фермента регистрируют по изменению рН, концентрации субстрата и продукта и т.д. в среде («макроокружении» фермента). В «микроокружении» эти же характеристики могут иметь другие значения 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем. Воздействие полимерной матрицы на «микроокружение» связано с эффектом рассредотачивания и с диффузионными ограничениями. Эффект рассредотачивания является следствием того, что полимер или притягивает, или отталкивает от собственной поверхности субстрат, продукт реакции, ингибитор либо 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем активатор и разные ионы, тем повышая либо понижая их концентрацию в растворе, в итоге чего их содержание вокруг фермента и во всей системе будет отличаться. Определенную роль в разработке 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем эффекта рассредотачивания играют также гидрофобные взаимодействия растворенных веществ с полимерной основой, специальные реакции меж носителем и растворенным веществом и т.д.

В процессе иммобилизации может быть затронута пространственная структура фермента. Если это связано 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем с хим модификацией многофункциональных групп белка, то для предотвращения такового явления нужно или защищать эти группы в процессе иммобилизации, или подбирать такие способы, которые не затрагивают эти группы. Когда предпосылкой нарушения конформации 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем фермента являются неспецифические взаимодействия меж ферментом и носителем (образование электростатических, гидрофобных и водородных связей), то, или, при помощи сшивающего агента отделяют молекулу фермента от поверхности носителя, или подменяют носитель на инертный по отношению 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем к катализатору. Иммобилизация увеличивает устойчивость фермента к наружным воздействиям, что связано с рядом причин: концентрацией субстрата, ограничением его диффузии и т.д.. Вследствие высочайшей локальной концентрации фермента и диффузионных ограничений при проникновении субстрата 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в гель, весь субстрат, проникший в гелевую ячейку, может быть «переработанным» даже тогда, когда часть молекулы фермента будет «инактивирована» (к примеру, термический обработкой) и т.д.

В ряде всевозможных случаев иммобилизация приводит 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем к понижению ферментативной активности. Предпосылкой такового явления могут быть стерические ограничения, возникающие в этом случае, когда иммобилизация каким-то образом мешает доступу субстрата и эффектора в полимерную матрицу. Для устранения таких 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем ограничений употребляют водорастворимые носители с маленький молекулярной массой, проводят деградацию носителей разными агентами и т.д., не изменяя первичную структуру и пространственную компанию иммобилизованного фермента. Стерические ограничения могут появиться вследствие "эффекта 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем неверного связывания", когда в процессе иммобилизации активный центр фермента блокируется полимерной матрицей. Инактивация фермента только через активный центр (без конформационных сдвигов) может появиться при проведении процесса иммобилизации в жестких критериях - высочайшее значение рН 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, присутствие свободных радикалов либо окисляющих агентов и другие.

Установлено, что изменение начальных либо действенных характеристик ферментов (рассредотачивание протонов) при иммобилизации приводит к модификации их рН-зависимости. Эти явления обоснованы или воздействием полиионных 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем матриц на рассредотачивание протонов, или ограничением диффузии протонов полимерной матрицей. Способность вызывать перераспределение протонов меж фазой свободного раствора и микроокружением фермента является общим свойством полиионных матриц, обусловленным присутствием заряженных (ионизированных 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем) групп. При всем этом полианионы стремятся сконцентрировать протоны, снижая при всем этом рН вокруг иммобилизованного фермента, тогда как поликатионы обычно отталкивают протоны, повышая тем рН. Полимерная матрица, на которой иммобилизован фермент, может 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем препятствовать свободной диффузии протонов, что в особенности приметно с возрастанием рН. Протоны же, в отличие от большинства других товаров биохимических реакций, оказывают влияние на активность фермента даже в этом случае, если их концентрация очень 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем мала. Потому при определении рН-чувствительности иммобилизованного фермента нужно учесть тот факт, что в «микроокружении» значение рН может отличаться от такого в «макроокружении» [37].

Иммобилизация вызывает изменение активности ферментов (а именно, величины 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем Км) вследствие вариантов параметров микроокружения. К примеру, когда молекулы фермента окружены не перемешиваемым слоем растворителя (слой Нернста), в каком концентрация субстрата ниже, чем в основной массе раствора, для насыщения иммобилизованного фермента требуется 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем более высочайшая концентрация субстрата. На величину Км может влиять ионная природа носителя, а именно, если субстрат заряжен. Уменьшение Км при иммобилизации дает дополнительные практические достоинства, так как при низких концентрациях субстрата быстроту реакции 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем будет выше, чем в случае свободного фермента. Повышение Км, напротив, значит, что для заслуги данной быстроты реакции требуется большая концентрация субстрата, чем для свободного фермента. На активность иммобилизованных ферментов, как 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и в случае свободных, могут влиять низко- и высокомолекулярные вещества, субстраты и продукты реакции. Неважно какая полимерная матрица, затрудняющая свободную диффузию субстрата, ограничивает и свободную диффузию продукта, в итоге чего концентрация продукта 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в «микроокружении» будет больше, чем в свободном растворе, и он будет ингибировать ферментативную реакцию.

В базе технологичности иммобилизованных ферментов лежит их высочайшая стабильность. Понятно, что инактивацию ферментов вызывают разные физические (температура, облучение, ультразвук 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и др.) и хим причины, в базе деяния которых лежат последующие молекулярные механизмы: а) агрегация за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий; б) изменение первичной структуры в итоге разрывов в полипептидной цепи 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и модификация многофункциональных групп фермента в итоге их окисления, расщепления дисульфидных связей, фосфорилирования, дезаминирования и т.д.; в) диссоциация олигомерных белков-ферментов на субъединицы при действии детергентов, мочевины, температуры и т.д 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем. Одними из более комфортных полимерных материалов для иммобилизации ферментов являются заряженные полиэлектролиты благодаря действенному электростатическому взаимодействию компонент, также способности разнообразить как символ, так и плотность заряда на поверхности комплекса. Невзирая на 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем огромное число публикаций по образованию комплексов меж 2-мя (анионным и катионным) полиэлектролитами, одним полиэлектролитом и ПАВ, белком и обратно заряженным полиэлектролитом [24, 38, 28-37], задачка иммобилизации ферментов в комплекс из 2-ух обратно заряженных полиэлектролитов с 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем образованием трехкомпонентной системы является принципиальной и животрепещущей.


^ Получение организованных мультислоев методом чередующейся адсорбции полиионов, микрочастиц и белков

Послойная сборка чередующихся слоев обратно заряженных полиэлектролитов и/либо микрочастиц позволяют сформировывать тонкие пленки (5-500 нм) с монослоями из разных 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем веществ, возрастающими в заблаговременно установленной последовательности на заряженном субстрате. Эта техника была названа “molecular beaker epitaxy” (молекулярная эпитаксия в пробирке) [30-37]. Это значит, что при помощи обычных способов можно получить молекулярно организованные системы 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем либо СБС, подобные пленкам, приобретенным дорогим и сложным способом молекулярной лучевой эпитаксии.

Процедура послойной самосборки представлена на рисунке 19 Основная мысль этого способа состоит в адсорбции полиионов, приводящей к чередованию концевых 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем зарядов после нанесения каждого слоя. Эта основная мысль предполагает, что на теоретическом уровне не существует запрета в выборе полиэлектролитов, при всем этом получены композитные полимерные пленки в границах от 5 до 1000 нм с точностью 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем более чем 1 нм и с заблаговременно определенным составом. Для удачной сборки пленки из микрочастиц либо белков важен порядок чередования их с полиионами. Гибкие линейные полиионы попадают меж микрочастицами и выступают в роли «электростатического 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем клея» (рис. 1.18). Концепция «электростатического полиионного клея», который соединяет совместно примыкающие микрочастицы, является основной в данном способе, в особенности плодотворна для иммобилизации ферментов [30-37].

Этот способ уже применяется для производства ультратонких пленок из 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем заряженных полимеров (полиионов) и микрочастиц (металлов, полупроводников, магнитов, ферроэлектриков и изоляторов), белков, красителей и других супрамолекулярных веществ [30-37]. В большинстве случаев употребляются последующие полиионы: поликатионы – поли(этиленимин) (ПЭИ), поли(диметилдиаллиламмоний хлорид) (ПДДА), поли(аллиламин 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем) (ПАА), полилизин, хитозан; полианионы – поли(стиролсульфонат) (ПСС), поли(винилсульфат), поли(акриловая кислота), гепарин, ДНК. Одна полимерная нанокомпозитная пленка может содержать до сотки коммерчески доступных полиионов.

Многослойные пленки, содержащие организованные 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем слои белковых частиц были собраны методом чередующейся электростатической адсорбции приемущественно с положительно заряженными ПЭИ, ПАА, ПДДА, хитозаном и негативно заряженными ПСС, ДНК и гепарином [30-37]. Величина рН белковых смесей выбиралась вдалеке от изоэлектирческой точки 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и таким макаром белки были заряжены, что являлось нужным условием опыта. Успешно была выполнена сборка пленок с 20 различными белками (в числе их, цитохром, карбоновая ангидраза, миоглобин, гемоглобин, родопсин, пероксидаза, алкогольдегидрогеназа, глюкоамилаза, глюкозооксидаза, иммуноглобулин 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, каталаза). Все белки подвергались чередующейся адсорбции с органическими полиэлектролитами огромное количество циклов. Белки, иммобилизованные в мультислои даже с сильными полиэлектролитами, обычно, не денатурировали [37].





Набросок 19 – Схема поликатион/полианионной чередующейся сборки: линейный полианион 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем с поликатионом и поликатион с микрочастицами [37]




Набросок 20 – Схема сборки полиион/микрочастица на сферических микроядрах





Набросок 21 – Уреаза, инкапсулированная в нанокапсулы поперечником 5 мкм, толщина стен 30 нм [37]



Не считая того, в неких случаях послойная иммобилизация в линейные 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и разветвленные полиэлектролиты увеличивала стабильность ферментов. Ферментативная активность в мультислоях росла линейно с повышением числа белковых слоев до 10-15, и в этой точке активность пленки становилась «насыщенной». Это «насыщение» может быть 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем обуславливается ограничением диффузии субстрата в пленку, т.е. пришествием предела доступности субстрата для фермента при неизменной скорости транспорта субстрата через мультислой [30-37].

Развитие техники сборки «полиэлектролитных пленок» для разных белков позволило конструировать 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем мультикомпонентные белковые пленки. Эти пленки очень увлекательны в качестве новых на биологическом уровне активных наноматериалов. Поочередные ферментативные реакции и перенос электронов и энергии становятся вероятными методом изготовления анизотропных белковых слоев с четким контролем за 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем расстоянием меж активными слоями [30-37]. Процесс сборки, разработанный для жестких носителей, может быть перенесен на пористые носители (хроматографические пластинки, мембраны, пористые волокна) либо на поверхность микро- и наноядер. Сборка оболочек наночастица-фермент-полиэлектролит 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем на микроядрах является перспективным инвентарем в разработке комплексов ферментных коллоидов [30-37].

Не так давно был описан [37] новый подход в построении трехмерных субмикронных структур с внедрением заряженного латекса и липидных трубок. При 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем всем этом поликатионный раствор добавлялся к негативно заряженному латексу либо другим ядерным частичкам. После того как прошла адсорбция, латекс отделяли от раствора поликатиона (обычно 10-мин. центрифугированием при 10000 g), и потом выдерживали латекс в полианионном растворе 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, и т.д.. К примеру, на рисунке 20 представлена сборка кремниевых сфер поперечником 75-нм на латексе поперечником 100 нм. Сборка оболочки проводилась в 2 шага: поначалу методом адсорбции катионного поли(этиленимина) изменялся заряд поверхности 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем отрицательного 200-нм латекса на положительный; а потом адсорбировались организованные частички кремния. Смешивание переделанных и невидоизмененных микрочастиц приводит к их флоккуляции и образованию суперкристаллов: огромные частички делятся слоем более маленьких частиц [37].

Способ послойной самосборки 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем был использован для сотворения тонких организованных оболочек на латексных ядрах. Организованные мультислои микрочастиц (9-, 20-, 45-нм в поперечнике частички кремния либо 12-нм магнетит) и глюкозооксидазы (ГОД) были собраны чередованием с обратно 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем заряженными полиэлектролитами на 420-нм латексных частичках. Поэтапный рост многослойной пленки был доказан способом микроэлектрофореза и электрической микроскопии. Введение слоя микрочастиц на латексе дает повышение площади поверхности, что приводит к большей адсорбции ГОД и, таким 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем макаром, к повышению каталитической активности биореактора. Биоактивность была пропорциональна площади поверхности ядра и количеству монослоев ГОД в оболочке. Не считая того, присутствие магнитных микрочастиц позволяет нанореакторам без помощи других перемешиваться с конфигурацией магнитного 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем поля и наращивает их продуктивность [35-37].

Существует также несколько другой подход в разработке «биореакторов»: после того как будет сформирована «поликатион-полианионная» оболочка, растворяют меланоформальдегидные латексные ядра при рН=1 и получают полые полимерные 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем капсулы с шириной стен 40 нм. Эти капсулы могут включать в себя разные ферменты. Продемонстрировано повышение каталитической активности ферментов, инкапсулированных таким методом. Ферменты в этих «биореакторах» защищены от деяния высокомолекулярных денатурирующих агентов и 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем ингибиторов, в то время как мелкие молекулы субстрата могут свободно достигать фермента.

Полые полиэлектролитные оболочки, собранные способом послойной самосборки, позволяют точно держать под контролем размер таких оболочек, толщину оболочки, состав оболочки и ее 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем проницаемость. В оболочки из линейных полиионов могут быть включены липидные бислои, ферменты и микрочастицы. Конструкция полых полиэлектролитных оболочек включает послойную адсорбцию обратно заряженных полиэлектролитов на каком-либо ядре с следующим разрушением 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем этого ядра. Процедура покрытия коллоидных частиц обратно заряженными полиэлектроли-тами является модификацией способа «самосборки» (рис. 19). После того как все данные полиэлектролитные слои были нанесены, покрытые частички подвергали воздействию раствора HCl 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем для разрушения ядра. После промывания системы были получены полые оболочки (рис. 21). Употребляют 2 метода нагрузки оболочек: а) нагрузка при низких значениях рН; б) нагрузка в консистенции воды и спирта. Оболочки, выдерживаемые при рН 4,5, образуют дыры поперечником 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем до 10 нм. По-видимому, изменение заряда полиэлектролитов под действием конфигурации рН вызывает образование пор либо разрыхление полиэлектролитной структуры, делая полимерные слои проницаемыми. Оболочки, выдерживаемые в консистенции вода:этанол 1:1 довольно проницаемы для проникания 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем глобул уреазы 5-нм в поперечнике через мембрану оболочки (рис. 21). Когда эти же оболочки помещали назад в воду, то они опять становились непроницаемыми (рис. 21). Разъяснение этого процесса состоит в том, что полиэлектролитная структура 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем становится «доменной» в водно-спиртовой среде, позволяя проникновение уреазы вовнутрь оболочки, в то время как при возвращении капсул в водную среду полиэлектролитные стены перебегают в закрытую структуру. Нелогичным способом были 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем инкапсулированы глюкозооксидаза, каталаза, миоглобин, гемоглобин, и химотрипсин. Ферменты в оболочках сохраняли биоактивность и повышали свою стабильность [37].

Таким макаром, реализация принципов сотворения супрамолекулярных ферментных систем либо СБСф – это довольно обыкновенные и действенные способы иммобилизации 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем либо послойной «самосборки» полимер-ферментных комплексов. Эти способы не требуют высочайшей чистоты компонент, могут быть автоматизированы и использованы для массового производства организованных нанокомпозитных биоматериалов.


^ 1.1.5 Иммобилизированные ферменты – устойчивые системы

В процессе иммобилизации часто происходит 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем частичная утрата активности фермента. Глубина этой «денатурации» находится в зависимости от параметров сшивающего агента и подложки, также от критерий проведения реакции. Экспериментальные данные свидетельствуют, что в почти всех случаях молекула белка при 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем иммобилизации фактически не меняет собственной нативной конформации и утрата активности связана с экранировкой активного центра поверхностью носителя. При подходящих обстоятельствах иммобилизованный фермент сохраняет начальную активность и даже превосходит ее, может быть 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем, за счет нужных конформационных конфигураций либо воздействия локальных параметров поверхности носителя. [1, 39]

В большинстве случаев иммобилизация приводит к существенному возрастанию стабильности фермента но отношению к нагреванию и действию денатурирующих агентов. По данным 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем П. Каплана (США), таковой лабильный фермент, как лактатдегидрогеназа, пришитая к стеклу, сохраняет свою активность в кислой среде без мельчайшего конфигурации в течение месяца. Нативный фермент в тех же критериях на сто процентов теряет активность 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем в течение 3-х часов. [1, 39]

При нагревании многие иммобилизованные на поверхностях ферменты отчасти теряют активность в исходный период, потом активность добивается некого неизменного значения, которое остается дальше постоянным. К примеру, активность 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем трипсина, пришитого к поверхности сефадекса при помощи бромциана, при 50 °С падает до 55 % от начальной, после этого инактивация фактически прекращается. Гомогенно растворенный трипсин вполне инактивируется в этих критериях в течение 6 часов. [1]

Можно мыслить, что скорость 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем и глубина инактивации иммобилизованных ферментов в известной степени находится в зависимости от числа связей молекулы белка с поверхностью носителя. Так, Д. Габил (Швеция) показал, что молекулы трипсина, пришитые одним либо 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем 2-мя мостиками к поверхности сефадекса, стопроцентно теряют свою активность в 8 М мочевине. Фермент, прикрепленный в 3-х точках, сохраняет в этой среде 30 % активности. Если трипсин связан с носителем в 4 точках, его активность стопроцентно сохраняется [1].

Физико-химические 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем закономерности иммобилизации ферментов исследованы еще пока недостаточно, но данные о стабильности ферментов свидетельствуют, что способ иммобилизации при правильном выборе носителя, сшивающего агента и критерий позволяет получить препараты ферментов, близкие 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем по свойствам к хим гетерогенным катализаторам [1, 39, 40].

На рисунке 22 схематически представлены главные принципно принципиальные методы иммобилизации ферментов. В первом случае (а) фермент пришит одной связью к поверхности носителя. Даже такая простая иммобилизация позволяет 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем стабилизировать фермент. Понятно, что некие протеолитические ферменты подвержены реакции автопротеолиза, в итоге чего стремительно пропадает их активность. Если же таковой фермент (к примеру, трипсин либо химотрипсин) привязать к поверхности, то межмолекулярное взаимодействие будет исключено и 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем автопротеолиз прекращается. Фермент можно привязать к поверхности и рядом связей, сочетая эти связи со связыванием ферментов меж собой, к примеру, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты (б), его 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем можно включить в гель либо в полимер (в). Можно соединять включение фермента в гель с пришивкой его к полимерным молекулам геля (г). Не считая того, иммобилизацию фермента можно выполнить инкапсулированием – созданием около молекул 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем фермента полупроницаемой капсулы, к примеру, включением фермента в липосомы.




Набросок 22 – Некие виды иммобилизации.

Связывание фермента с носителем осуществляется методом образования ковалентных связей меж ферментом и матрицей; полимеризацией мономера; благодаря электростатическому взаимодействию обратно заряженных групп 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем фермента и матрицы; сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу; связыванием фермента и матрицы в итоге невалентных взаимодействий – гидрофобных, с образованием водородных связей и др.



12-arhitektura-klient-server-i-klient-servernie-tehnologii-tema-osobennosti-raboti-v-mnogopolzovatelskih-sredah-6.html
12-bakteriologicheskie-svojstva-morskoj-vodi-i-v-chelishev-treskuchie-kristalli.html
12-byudzhetnoe-ustrojstvo-sovremennoj-rossii-federalnoe-kaznachejstvo-i-ego-rol-v-kontrole-za-rashodnoj-chastyu.html